不同年份2.3.4.4分支H5亞型禽流感病毒HA基因的序列分析

摘要：H5亞型禽流感2.3.4.4分支病毒已流行了幾年，當前的流行毒株是否會因變異而導致免疫失敗引起關(guān)注。本研究對近年來流行毒株進行測序，比較分析了其抗原位點的變異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2017年的流行毒株已發(fā)生較大的變異，形成了一個獨立的分支，與其之前的毒株HA核苷酸序列的差異達4.4%-5.4%。其最大特征是HA蛋白的142位E（按A/Goose/Guangdong/1/96毒株排序）發(fā)生缺失，導致該處增加了1個糖基化位點；同時受體結(jié)合位點的口袋右緣發(fā)生L145S的變異，而這一位點變異時間在2016年的毒株就已產(chǎn)生；2017的毒株另有12個aa發(fā)生了較為一致的變異。故推測當前毒株的抗原性已發(fā)生了較大變化。但238位（H3排序226位）勻為Q，保持禽源毒株的特征。需采取增加疫苗免疫頻次及劑量，強化生物安全措施加以防控。

關(guān)鍵詞：H5；2.3.4.4分支； HA；序列分析

H5亞型離流感自1996年發(fā)現(xiàn)以來已流行了20多年，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失，同時對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴重威脅。病毒在這其間發(fā)生了多次的變異，產(chǎn)生了0-9分支，共10個不同分支的毒株。每間隔3-4年H5亞型流感病毒發(fā)生1次新的優(yōu)勢流行毒株的更疊，疫苗也隨之不斷更換。當前流行毒株主要為2.3.4.4分支，與其相對應的疫苗為Re-8疫苗，該分支毒株由2008年出現(xiàn)的2.3.4分支進化而來，2014年在韓國、越南等國流行以來, 已有幾年，近期生產(chǎn)上也有免疫失敗情況增多的反映，當前流行毒株是否發(fā)生了變異，引起特別關(guān)注。本研究選取日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的陽性樣測序結(jié)果進行分析，旨在了解當前毒株的變異情況，指導生產(chǎn)與防控工作。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品：拭子樣品8份，不同年份的采集于活禽交易市場。

1.1.2試劑：抽提試劑RNAiso Reagent、一步法RT-PCR擴增試劑（PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit ），購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 HA基因的擴增引物：上游引物P1：5`-CAGGGAGCAAAAGCAGGGGTYCAAT-3`；下游引物P2：5`- GGTGGATTCTCTGTCTGCAGCGTAC-3`，P3: 5`-CTACTAGATCCCAAGTAAACGGGCAAC-3`；下游引物P4：5`-AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTACAAT-3`，上海立菲生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1 RNA的提�。喊闯樘嵩噭┎僮髡f明書進行。

1.2.2 HA基因擴增體系與程序：上、下游引物(25μM)各1μL、2×Bμffer 25μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL 、DEPC水11μL和所提取的病毒RNA 10μL，體系共50μL，反應程序為50℃ 30min，95℃ 2min，然后95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min，30個循環(huán)，72℃延伸8min。

1.2.3序列測定和分析

將PCR產(chǎn)物送上海立菲生物工程有限公司進行測序，結(jié)果用DNAstar軟件進行序列拼接。并與下載自GenBank 的禽流感病毒祖先代表株A/goose/donguan//2017/H5的HA基因組序列進行比較, 采用MEGA 5.0軟件繪制其HA因組的系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1HA 基因擴增結(jié)果

擴增出大小分別為1191bp和1057bp的特異性條帶，與設計預期相符。見圖1。

圖1  PCR擴增結(jié)果

M、DNA Marker DL2000；1-8、P1P2擴增結(jié)果；9-16、P3P4擴增結(jié)果

2.2HA基因遺傳進化分析

將2017年的毒株A/goose/donguan//2017/H5，通過與Genbank上收錄的序列進行比較，結(jié)果相似性最高的為KY415645(A/chicken/Ganzhou/GZ21/2015/H5N6)，二者核苷酸的相似性為98%。從進化樹可以看出近年毒株可分為2個分支。其中2017年的3個株毒已形成一個獨立的分支；2013-2016年形成另一個分支，該分支各毒株間也有一定的差異，但不同年份毒株的差異不具有時間規(guī)律性。與最早出現(xiàn)的高致性H5代表株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)相比有較大的差異，見圖2。當前最新的2017年毒株與A/Goose/Guangdong/1/96相比，核苷酸差異已達10.1%-10.2%，與2016年毒株相比差異性為4.2%-4.8%，與2015年毒株相比差異性為5.1%-5.4%，與2014年之前的毒株相比差異性為4.4%-4.5%。2017年3個毒株間的差異較小，僅為0.4%-0.7%。2016年以前的毒株間的差異相對較小，2.1%-3.8%。

圖2 H5HA基因的系統(tǒng)進化樹

▲為2017年毒株

2.3HA 基因氨基酸序列分析

2017年病毒的cDNA 均包含了一個完整的開放閱讀框架(ORF)，編碼區(qū)長1701，共編碼566個氨基酸（aa），包括信號肽( 1-16aa) ，HA1 (17-343aa)，HA2 (345-566aa)和1個精氨酸(344aa)。2016年以前的毒株則在HA1多1個氨基酸。

2.4糖基化位點與裂解位點的分析

氨基酸序列分析結(jié)果表明，2016年以前的毒株HA基因的潛在糖基化位點有7個，分別位于 26-28、27-29、39-41、 181-183 、302-304、500-502、559-600位aa位點上，位點1-5位于HA1，位點6-7位于HA2。2017年毒株潛在糖基化位點增加至8個，在140-142位增加了1個位點，主要是由于2017年毒株發(fā)生142位E缺失后產(chǎn)生，這是近期毒株的重要變異之一。裂解位點方面，各毒株呈現(xiàn)強毒的分子特征，PLRERRRK/RGLF，堿性氨基酸較A/Goose/Guangdong/1/96株少1個，詳見表1。

表1 潛在糖基化位點分析

注：序號2－8為參考毒株。有下劃線的為新增的位點。

2.5受體結(jié)合位點分析

HA蛋白的受體結(jié)合位點（Receptor Binding Site，RBS）是病毒感染識別和結(jié)合細胞受體的部位，HA三聚體的每1個單體都具有1個RBS，包括口袋左緣236-240位（NGQSG），口袋右緣145-149位（SGVSS）、口袋底部107位Y和165位W、口袋后壁202位E和206位L。本研究中2.3.4.4毒株的受體結(jié)合位點的較一致，但從2016年的毒株開始，在口右緣發(fā)生了L145S的變異，這可能導致宿主范圍和抗原性發(fā)生改變。238位（H3排序226位）勻為Q，保持禽源毒株的特征。2017年以后的毒株另有12個位點發(fā)生了較一致的變異，主要集中在HA1肽段，其中142位E出現(xiàn)了缺失是一個重要的特征。56、131、139和145位較之前2.3.4.4分支的毒株發(fā)生了變異，但與H5亞型流感的祖先毒株A/Goose/Guangdong/1/96株一致，呈現(xiàn)出返祖的現(xiàn)象，推測其抗原性較早前的毒株更為接近。詳見表2。

表2  HA受體結(jié)合位點及其他變異位點分析

注：1.HA蛋白氨基酸序列按A/Goose/Guangdong/1/96毒株；2.238-240位氨基酸分別對應H3排序的226-228位氨基酸；3.加下畫線的為變異的位點。

3討論

3.1我國在2004年禽流感之后普遍采用疫苗免疫加撲殺作為主要的防控手段，在高強度的免疫壓力下，增加了病毒變異的可能性，導致各種新流行株的出現(xiàn)。疫苗也隨之不斷更換，當前使用的Re-8已推出2年，部份地區(qū)有免疫失敗的反映，當前流行毒株的變異情況是否達到導致免疫失敗的程度，成為關(guān)注的焦點。本研究通過對HA基因核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)2017年的流行毒株已較以往毒株已發(fā)生較大的變異，單獨處于一個分支上，核苷酸序列較2016年以前的毒株差異性為4.2%-5.4%，與祖先毒株A/Goose/Guangdong/1/96相比，核苷酸差異已達10.1%-10.2%。2017年后出現(xiàn)這一較大的變異很可能導致與當前使用的疫苗株的匹配性較大幅度下降。

3.2 進一步對推導的HA蛋白的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)2.3.4.4分支的流行毒株2017年后發(fā)生多個位點的變異。其最大特征是142位E（按A/Goose/Guangdong/1/96毒株排序）發(fā)生缺失，同時導致該處增加了1個糖基化位點140NHT142，使?jié)撛谔腔�化位點增加至8個。受體結(jié)合位點中口袋右緣發(fā)生L145S的變異，而這一位點變異時間在2016年的毒株就已產(chǎn)生，2017的毒株另有12個位點發(fā)生了較為一致的變異。故推測當前毒株的抗原性已發(fā)生了較大變化。有趣的是2017年毒株在12個變異位點中有4個位點的呈現(xiàn)出返祖變異現(xiàn)象，故推測當前流行毒株的抗原性與較早前的流行毒株更為接近。

3.3 2014年在四川省出現(xiàn)首例人感染H5N6病例以來，在云南、廣東、湖北和安徵引起多例人的感染，本研究中6個毒株HA蛋白238位（H3排序226位）勻為Q，保持禽源毒株的特征，人源毒株也有相似的情況。還與其他基因位點有關(guān)，不排除其他位點的改變引起宿主范圍的變化。

3.4 關(guān)于防控措施。根據(jù)以往的流行規(guī)律，在流行毒更疊時期，水禽的風險較大，需引起特別關(guān)注。由于水禽是流感病毒的自然宿主，在長期的生物進化過程中對流感病毒的敏感性下降，疫苗免疫反應較差，導致產(chǎn)生的抗體水平不高，一旦流行毒株的抗原性與疫苗毒株的匹配性下降，水禽的發(fā)病風險則較大，由于疫苗毒株的更換需要一定的條件和時間，故當前只能加大免疫頻次和劑量。水禽特別是櫻桃谷鴨等，雖然飼養(yǎng)周期短，最少進行兩次以上的免疫，劑量適當加大，例如7-10d  0.5mL，13-20d 1.2mL。同時做好生物安全措施，特別是隔離消毒好與市場有關(guān)的車輛與籠具。

作者：廣東省動物疫病預防控制中心 盧受昇，孫彥偉，查云峰，葉健，吳立煬

來源：《動物防疫一線》2018年第3期