中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室成功分離了我國第一株ASFV，對其感染性、致病力和傳播能力等生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并建立了動物感染模型；初步闡明了我國ASFV流行毒株的基因組特點(diǎn)和進(jìn)化關(guān)系，為我國ASF疫情的有效防控提供了重要科學(xué)依據(jù)，為檢測技術(shù)和防治疫苗研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在新發(fā)傳染病專業(yè)期刊《Emerging Microbes and Infections》。

趙東明、劉任強(qiáng)等人利用2018年9月3日黑龍江省佳木斯疫情發(fā)病豬樣品，接種豬原代肺泡巨噬細(xì)胞，成功分離出我國第一個ASFV毒株（Pig/HLJ/18）。

中國的生豬產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的50%。自2018年8月非洲豬瘟病毒（ASFV）進(jìn)入中國以來，該病毒已迅速擴(kuò)散至中國全境，嚴(yán)重威脅了中國的生豬養(yǎng)殖業(yè)。本研究利用原代豬肺泡巨噬細(xì)胞從ASFV暴發(fā)豬場的樣本中分離到ASFV 毒株P(guān)ig/Heilongjiang/2018 (Pig/HLJ/18)，并采用紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)（HAD）、蛋白免疫印跡、免疫熒光和電鏡技術(shù)對該毒株的特性進(jìn)行了研究。針對ASFV p72基因的進(jìn)化分析顯示，Pig/HLJ/18為基因2型。病毒在原代巨噬細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞的效價可達(dá)10^7.2 HAD₅₀/ml。肌肉接種10^3.5–10^6.5 HAD₅₀不等劑量的SPF豬可出現(xiàn)高熱、出血等急性癥狀。接種豬的潛伏期為3-5天，在接種后6-9天死亡；接觸豬的潛伏期則為9天，在接觸后的13-14天死亡。接種豬在接種后第二天出現(xiàn)病毒血癥，接觸豬的病毒血癥則出現(xiàn)于第9天�？谇缓椭蹦c拭子分別在在接種后2-5天和接觸后6-10天可檢出病毒DNA。上述結(jié)果說明Pig/HLJ/18對豬具有高度致病性和快速傳播能力。ASFV危脅極大，其控制和清除工作十分必要。

圖1. 田間脾臟樣本中對ASFV的檢測。（A）對疑似感染豬脾臟DNA的PCR檢測。第一泳道為樣品，第二泳道為陽性對照質(zhì)粒；第三泳道為陰性對照。（B）脾臟勻漿的紅細(xì)胞吸附分析。脾臟勻漿上清被稀釋10倍后接種豬PBMC細(xì)胞，添加1%豬血細(xì)胞。紅細(xì)胞吸附觀察期為7天。

圖2. 病毒在原代豬肺泡巨噬細(xì)胞上的復(fù)制。原代豬肺泡巨噬細(xì)胞接種MOI=0.2劑量的Pig/HLJ/18 ，細(xì)胞上清被用于（A）感染性病毒顆粒的檢測和（B）p72基因的定量。原代豬肺泡巨噬細(xì)胞感染Pig/HLJ/18后被裂解，產(chǎn)物用于病毒p30蛋白的檢測（C）和免疫熒光分析（D）。細(xì)胞上清中的病毒顆粒被負(fù)染后用于電鏡觀察（E），感染后48H的細(xì)胞被用于超薄切片觀察。

圖3. 針對Pig/HLJ/18 p72基因的進(jìn)化分析。ASFV參考毒株的p72基因序列下載于NCBI數(shù)據(jù)庫。該圖基于鄰接法由MEGA X軟件繪制。每個分支上的數(shù)字顯示Bootstrap值>70%。本研究的ASFV分離毒為黑色菱形標(biāo)記。白色三角代表中國首個案例的ASFV序列。比例尺為每個位點(diǎn)的核苷酸替換數(shù)。

圖4.Pig/HLJ/18 感染豬樣本的病毒基因組拷貝數(shù)。血液、口腔拭子和直腸拭子于指定時間收集于接種劑量為10^3.5 HAD₅₀ 的三頭感染豬。病毒p72基因的拷貝數(shù)由熒光定量方法測定。黑色虛線代表未感染組的檢測極限。

圖5. HAD分析所測得的血液和器官中的病毒滴度。血液收集于不同接毒劑量的接種豬（A-D）和接觸豬（E-F）。（A) 10^6.5 HAD₅₀劑量接種豬; (B) 10^5.5HAD₅₀劑量接種豬; (C) 10^4.5劑量接種豬; (D) 10^3.5HAD₅₀劑量接種豬; (E)10^4.5HAD₅₀劑量接種豬的接觸豬; (F)0^3.5HAD₅₀劑量接種豬的接觸豬。（G）接種豬和接觸豬肝臟和脾臟中的病毒滴度。樣品收集于剖檢時，每頭豬的病毒接種劑量顯示于每個圖的上方。 

圖6. 接觸豬樣本的病毒基因組拷貝數(shù)。血液、口腔拭子和直腸拭子于指定時間收集于兩頭接觸豬，這兩頭豬分別與接種劑量為10^4.5 HAD₅₀和10^4.5 HAD₅₀接種豬同居。黑色虛線代表檢測極限。

圖7. 死于Pig/HLJ/18 感染的豬的臟器損傷。所有豬的損傷在附表中進(jìn)行了概述。10^6.5HAD₅₀接種劑量豬的心、肺、膽、脾、腸系膜淋巴結(jié)和胃肝損傷如圖所示。（A）心外膜嚴(yán)重彌漫性出血（B）輕度肺間質(zhì)水腫，插入物是對框架區(qū)域的放大（C）膽囊壁和肝臟嚴(yán)重出血、水腫，插入物是對圓形區(qū)域的放大（D）脾臟嚴(yán)重腫大、易碎、呈暗黑色（E）腸系膜淋巴結(jié)輕度腫大，外觀紅黑（F）胃肝淋巴結(jié)腫大出血

陳佳寧編譯